09_REPLICACIÓN DEL ADN

1.INTRODUCCIÓN: FLUJO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA (DOGMA CENTRAL)

En una célula para que tengan lugar el proceso de transcripción, no es necesario que se produzca previamente la replicación del ADN, ya que estos dos son procesos independientes (que es lo que intentamostrar la imagen).

Es decir, la vía de transmisión (replicación), que únicamente tiene lugar cuando la célula va a dividirse, para así obtener el doble del material genético y poder transmitirlo a las dos células hijas, no tiene nada que ver con la vía de expresión de la información genética (paso de información del DNA a RNA mediante el proceso de transcripción y su posterior traducción para dar lugar a las cadenas peptídicas), que está ocurriendo continuamente.

2. REPLICACIÓN

Como ya dijimos es el proceso bioquímico, por el cual  a partir de una molécula de DNA, obtendremos dos moléculas “hijas” de DNA idénticas a la original.

El proceso de forma simple, podría resumirse como la copia de una secuencia del material genético, teniendo en cuenta la especificidad en la complementariedad de bases.

CARACTERÍSTICAS:

• Proceso diseñado para trabajar con una gran operatividad; es decir, se tiene que hacer muy rápidamente ya que el ciclo de la célula es muy corto. Al mismo tiempo, se tiene que hacer con mucha fidelidad, para evitar errores, pues cada uno de esos errores provoca una mutación en la célula.
• Es semiconservativo: cada molécula hija está formada por una hebra parental (procedente de la original) y una hebra de nueva síntesis.
• Es completo, total, es decir, todo el DNA de la célula se tiene que replicar (diferencia fundamental con la transcripción, el cual va a ser un proceso selectivo)
• Está ligado al ciclo celular, cuando repliquemos el DNA (en la fase S del ciclo celular), la célula se obligará a realizar inmediatamente la división celular pasando el DNA replicado a las células hijas (exceptuando las células cancerígenas)
• En procariotas, la replicación se realizar a partir de un solo punto (gen oriC), en personas, puede haber miles de orígenes de replicación.
• El DNA que se replica a partir de un único origen se llama replicón; (Es decir, en bacterias solo hay un replicón, en personas puede haber múltiples)
• Es bidireccional (diferencia con la transcripción): a partir de cada punto de origen, la replicación progresa en ambos sentidos a nivel macroscópico, ya que cuando analizamos como se fabrica el DNA en cada una de esas horquillas de replicación y en cada una de las hebras (en cada horquilla tenemos dos hebras que se tienen que replicar) solamente se realiza 5´-3´
• La síntesis de DNA es siempre en sentido 5´-3´ y las hebras presentan carácter antiparalelo, lo que implica giros en el DNA para poder llevar a cabo la síntesis en una de las hebras (retardada) que va a hacer su síntesis a fragmentos (fragmentos de Okazaki), pero siempre (ya sea la hebra conductora o retardada) la síntesis siempre será 5´-3´.
• La replicación (a diferencia con la transcripción) va a estar caracterizada por la capacidad de corregir los propios errores.
• La síntesis de DNA la realizan las DNA polimerasas, las cuales al igual que otros enzimas que participan, son enzimas que se llaman de doble lectura, es decir, que cuando catalizan una reacción (en este caso, síntesis de DNA), experimentan cambios conformacionales (nuevas disposiciones de los grupos químicos), y tras estos cambios, comprueban si lo que se ha hecho es correcto o no, es decir si el nucleótido que se ha polimerizado es el adecuado. Si lo es, el enzima sigue funcionando, pero si no, el enzima va a tener una actividad que le permite eliminar ese nucleótido y volver a hacer más (enzimas de doble lectura con capacidad de corregir los errores). Diferencia con la transcripción, cuyos cambios en el RNA no son tan significativos, ya que la duración de vida de ésta es mucho más corta.
• Es un proceso que consume mucha energía, con la incorporación de cada nucleótido en la secuencia de DNA que se está fabricando (partiendo del nucleótido trifosfato, incorporando el monofosfato y se liberan los dos fosfatos terminales en forma de pirofosfato que las pirofosfatasas cortan) se consumen dos enlaces de alta energía por cada nucleótido que incorporemos.
• Las DNA polimerasas no actúan solas, si no con un gran número de proteínas, de las cuales la mayoría consumen también mucha energía, por lo que va a ser un proceso muy costoso desde el punto de vista energético.
• A nivel mecánico es un proceso muy complejo, ya que tiene que realizarse muy deprisa, aunque a nivel bioquímica sea sencillo, y con una gran fidelidad y complejo de macromoléculas para poderlo llevar a cabo.

DNA POLIMERASAS:

Son las  enzimas encargadas de la fabricación del DNA. Los requerimientos para su funcionamiento son:

• Molde de DNA: una hebra monocatenaria de DNA, que les indique el orden en el que tienen que ir poniendo los nucleótidos por complementariedad; es decir, son meras copiadoras, si no se les da una secuencia para copiar, no hacen absolutamente nada.
• Cebador (o primer): secuencia corta de nucleótidos (DNA, in vitro o RNA, in vivo). Les proporciona un extremo 3´ OH libre, sobre el que las DNA polimerasas pueden ir ya colocando los siguientes nucleótidos.
• Sustratos para la fabricación de DNA: Desoxirribonucleótidos (dNTP) trifosfato y Mg²⁺, este último sobre todo para aquellas reacciones en las que participan el ATP y nucleótidos, porque las enzimas (en este caso DNA polimerasas) las utilizan como complejos con el magnesio, que bloquea parte de la carga negativa que presentan los nucleótidos.
• La reacción que catalizan, es una reacción muy sencilla, es única y exclusivamente de elongación de polimerización, que va a ir avanzando en sentido 5´-3´.

En resumen, lo que hacen es tomar el molde de DNA, el cebador, y seleccionar el dNTP por complementariedad con las bases del molde, añadiendo el nucleótido monofosfato en la secuencia y liberando los dos fosfatos terminales de eso nucleótido trifosfato en forma de pirofosfato, que inmediatamente las enzimas pirofosfatasas (muy activas en las células) lo rompen en dos moléculas de fosfato inorgánico. Así la hebra de DNA que se esté formando va a ir creciendo nucleótido tras nucleótido 5´-3´. Esto implica que se consumen dos enlaces rico-energéticos por cada una de las dos hebras al liberar el pirofosfato roto por las pirofosfatasas, esto da energía para desplazar el proceso en el sentido de la polimerización.

Señalar como aspecto muy importante de la reacción, que es bidireccional, ya que el enzima presenta actividad exonucleásica 3´-5´ que va a permitir comprobar si la secuencia es correcta, y si no lo es volver hacia atrás quitar el nucleótido erróneo y poner el correcto (capacidad correctora)

Las correcciones realizadas por las DNA polimerasas, se llevan a cabo a la misma vez que se está sintetizando el DNA

A nivel bioquímico, el proceso del DNA en la replicación y el del RNA en la transcripción, son idénticos. En la transcripción, la RNA polimerasa que son las que sintetizan el RNA seleccionan el nucleótido trifosfato por complementariedad con el molde e incorporan el nucleótido con un fosfato en la secuencia alargando cada vez un nucleótido en dirección 5´-3´. Diferencias esenciales:

– En la transcripción no se necesita cebador, pues puede comenzar desde cero, a partir de unir los dos primeros nucleótidos determinados por el molde y no va a haber capacidad de volver hacia atrás (no capacidad exonucleásica).

DNA POLIMERASAS EN PROCARIOTAS Y SU FUNCIÓN:

• DNA polimerasa I: actua en la hebra retardada (la que se sintetiza a partir de los fragmentos de Okazaki) eliminando los trozos de RNA, de cebador y sustituyéndolos por DNA continuo, con la acción de las ligasas
• DNA polimerasa II: No participa en la replicación, aunque forma parte de la reparación del DNA.
• DNA polimerasa III: Realiza la síntesis de DNA durante la replicación, también es la que realiza la corrección al mismo tiempo que sintetiza, con su actividad polimerásica (5´-3´), y exonucleásica 3´-5´y 5´-3. Básicamente es la que va a realizar toda la síntesis de DNA.

DNA POLIMERASA III:

• Tiene un tamaño enorme (900 kilodalton)
• Se suele hacer referencia a ella como dímero asimétrico, aunque realmente ese término no es correcto, porque no nos estamos refiriendo a dos cadenas polipeptídicas si no que son dos agregados de cadenas polipeptídicas de varias subunidades, que no van a ser idénticos uno al otro. Por eso se le llama dímero asimétrico.
• Los dímeros asimétricos no son iguales porque no van a realizar la misma función uno que otro. El dímero izquierdo, se va a encargar de la síntesis de DNA de la hebra conductora, la que se realiza sin problemas desde el inicio al final. Por tanto, este dímero tendrá menos subunidades que el de la parte derecha que es el que va a realizar la síntesis de DNA en la hebra retardada, la que se va a hacer a partir de los fragmentos de Okazaki
• Los dos dímeros van a mantenerse unidos actuando como un agregado durante toda la replicación (nunca se separan)
• Dentro de las subunidades que forma la ADN polimerasa III, tenemos básicamente dos partes:
  • Parte central (parte del recuadro en la imagen): se corresponde con el núcleo de la enzima, la partícula central, que está formado por 3 subunidades en cada parte (alfa, Epsilon y beta). En esta parte se encuentra la capacidad de la enzima para polimerizar el DNA, y la capacidad de autocorrección; es decir, donde está la actividad exonucleásica 3´-5´. En esencia la replicación se va a hacer en esta partícula central.
  • Dos unidades beta en cada uno de los agregados: forman como una especie de círculo en tordo al ADN, que es como una pinza y va a impedir que el ADN se separe de la DNA polimerasa durante el proceso de replicación. Por lo tanto el resto de subunidades (en este caso la beta) lo que van a dar es la capacidad de unirse al DNA y de impedir que el DNA se disocie durante el proceso de elongación (procesividad). Esta es una de las consecuencias por las que el DNA tiene que invertir su sentido para poder replicar la hebra retardada.
  • Cuatro subunidades en la parte de la síntesis de la hebra retardada: sirven para permitir que el DNA invierta su sentido y pueda ser copiado a medida que avanza la DNA polimerasa en la hebra retardada.
• El conjunto de todas las subunidades funciona muy bien, permitiendo una capacidad de síntesis de 1000 polinucleótidos por segundo en el caso de E. coli, actuando con una gran fiabilidad.

3. PROTEÍNAS NECESARIAS PARA LA REPLICACIÓN. REPLICACIÓN EN PROCARIOTAS

La replicación en procariotas tiene un solo origen de replicación, que empieza en el gen OriC (aproximadamente 245 pares de bases). Dentro de este gen encontramos dos tipos de secuencias:

• Repeticiones que permiten que la proteína DnaA (localizadora del inicio de la replicación) interaccione o se una con el gen OriC
• Repeticiones ricas en A – T (color rojo)

La replicación comienza cuando las DnaA se unen a estas secuencias del Dna dando lugar a una unión cooperativa que hace que el Dna se enrolle créanse entorno a ellas una tensión que permite la desnaturalización local o separación de las dos cadenas en las regiones ricas en A – T (puesto que las secuencias G – C son más estables debido a los puentes de H).

Una vez separadas las dos hebras, la apertura se va agrandando por la unión de las helicasas, que rompen los puentes de H, y el DNA monocatenario se estabiliza con proteínas SBSS.

Para que el proceso avance se requiere la acción de determinadas proteínas, que se incorporan en esta apertura:

• Topoisomeras II o DNA girasas: cuando se separan las doshebras del DNA se produce un superenrollamiento +(positivo) en los extremos de las horquillas, por lo que este enzima introduce superenrollamientos – para compensar esta tensión, sino el proceso no podría avanzar debido a que la tensión producida por el superenrollamiento +.
• Primasa (cebador), RNA polimerasa-DNA dependiente: se introduce en la apertura para poder sintetizar el cebador, a partir del cual se puede fabricar DNA mediante la incorporación de la DNA polimerasa III.

A partir del oriC, a ambos lados de la apertura, se sitúan las dos maquinarias que se mueven en direcciones opuestas formando las dos horquillas de replicación, que permiten replicar el DNA, pues las hebras se encuentran en antiparalelo. Por tanto, se trata de un proceso bidireccional.

La hebra conductora no tiene ningún problema de replicación porque el sentido de avance de la horquilla de replicación coincide con el sentido de polimerización de la DNA polimerasa (5’-3’),  por lo que a medida que se desenrolla el DNA se puede copiar la hebra conductora. Pero en el caso de la hebra retardada, al ser antiparalela, el avance de la maquinaria de replicación es contrario a la dirección de síntesis de DNA de la DNA polimerasa, por lo que esta hebra tiene ciertos problemas en su replicación. Esto implica que su síntesis se va a hacer a fragmentos, lo que se llaman fragmentos de Okazaqui. Cada uno de estos fragmentos comenzará su síntesis por un trozo de DNA que ha fabricado la primasa, y continuará con un fragmento de DNA que ha fabricado la DNA polimerasa III. Esta hebra retardada, como la DNA polimerasa cuando se une al DNA no se separa de él (procesividad), para poder sintetizar en sentido 5’-3’, el DNA tiene que invertir su sentido y hacerlo coincidir con el de avance de la maquinaria replicativa para poder ser copiada. Esto es lo que se conoce como bucle, lo que hace el DNA para orientarse y ponerse en sentido correcto. Por tanto, lo que ocurre es que la DNA polimerasa III de la hebra retardada pasa dos veces por la hebra:

• La primera vez, al no poder copiar las secuencias porque avanza en dirección opuesta al de polimerización, la primasa va fabricando los cebadores (primers) que quedan pegados en la hebra de DNA, y como es una hebra monocatenaria el resto 8espacio entre cebadores) se estabiliza por acción de la proteína SSB
• Tras esto, el DNA se desplaza nuevamente sobre el núcleo de la DNA polimerasa, de forma que a medida que avanza puede copiar los fragmentos entre los cebadores.

http://www.youtube.com/watch?v=-mtLXpgjHL0

Para poder obtener DNA continuo en la HEBRA RETARDADA se requiere la acción de la DNA polimerasa I (traslación de la mella) y de la ligasa:

• DNA polimeras I: se encarga de unirse al hueco que hay entre dos fragmentos de Okazaqui. Este enzima tiene 3 actividades enzimáticas:

1. Polimerización 5’ – 3’, como todas las DNA polimerasas
2. Act. Exonucleásica 3’ – 5’ que le permite corregir el DNA a medida que lo va fabricando
3. Act. Exonucleásica 5’ – 3’ que le permite eliminar nucleótidos es eliminar el cebador de RNA con su actividad exonucleásica 5’-3’. Esta va a ser la que utilice la DNA polimerasa I para degradar el RNA que había como cebador en cada fragmento de Okazaqui.

En primer lugar, la DNA polimerasa 5’-3’ elimina el cebador, quedando un trozo de DNA sin copiar. Por ello, este enzima, a medida que va eliminando el cebador en sentido 5’-3’ rellena el hueco del cebador con DNA del fragmento de Okazaqui adyacente utilizando su actividad polimerásica 5’-3’, al mismo tiempo que corrige el DNA que fabrica.

Por todo ello se dice que la DNA polimerasa I cataliza el desplazamiento de la mella (discontinuidad en el DNA, falta un enlace fosfodiéster)

• Ligasas: establece un enlace éster entre extremo 3’-OH y 5’-P de dos fragmentos de Okazaqui consecutivos con gasto de energía en forma de ATP dando lugar a una hebra conductora y en consecuencia a una DNA continuo.

4. DIFERENCIAS ENTRE PROCARIOTA Y EUCARIOTA

1. La replicación en células eucariota es más complicada y desconocida
2. En las cél. eucariota hay múltiples orígenes de replicación (1000-10000) mientras que en procariota sólo hay uno. Además, todos estos orígenes de replicación no se activan al mismo tiempo, la eucromatina (se expresa) aparece antes y se extiende a la heterocromatina
3. La velocidad en eucariota es menor, de unos 50 nucleótidos por segundo, mientras que en las procariota es de 1000
4. Los fragmentos de Okazaqui en eucariota son más cortos
5. Las DNA polimerasa en eucariotas son más numerosas:
   • a –> replicación hebra retardada
   • b –> reparación dna
   • g –> replicación dna mitocondrial
   • d –> replicación hebra contínua formando el complejo-PCNA (Antígeno nuclear de las células en proliferación) uniendo la polimerasa al DNA
   • e –> replicación / reparación dna
6. Durante la replicación se tienen que desorganizar la estructura de los nucleosomas y volver a formarse cuando termine el proceso. Esta unión de las histonas para formar el nucleosoma se controla al inicio, tanto en procariota como en eucariota.
7. Telomerasas: en eucariotas, los cromosomas son moléculas lineales, es decir, en este caso hay problemas de replicación en los extremos de los cromosomas.

5. IMPORTANCIA DE LAS TELOMERASAS

Nuestros cromosomas son lineales, no circulares como ocurre en las células procariota, y puede ocurrir que en los extremos de la secuencia del cromosoma haya un origen de replicación. Cuando esto ocurre y los cebadores de los fragmentos de Okazaqui se eliminan, es necesario rellenar este hueco, porque sino el DNA se iría haciendo progresivamente más corto conforme se vata replicando. Para evitar esto actúan las telomerasas, exclusivas de los eucariotas, que impiden este acortamiento de los extremos de lo cromosomas en cada división celular.

Las telomerasas son ribonucleoproteínas, es decir, tienen una cadena proteica unida a una molécula de RNA. Además la parte de RNA tiene una secuencia idéntica a la que tenemos repetida en los telómeros de los cromosomas (DNA altamente repetido, formado por una secuencia corta que se repite una al lado de la otra), por lo que se cree que la telomerasa funciona como una transcriptasa reversa, es decir, a partir del RNA que tiene, hace copias en forma de DNA (transcriptasa reversa) dejándolas pegadas en el extremo 3’ del DNA.

El resultado de su acción es que a partir del trozo que ha alargado del telómero podemos encontrar un cebador con el que completar lo que no habíamos replicado del cromosoma. Pero al hacer esto se alargan los telómeros, por lo que las telomerasas, junto con otras proteínas, forman un complejo sistema que mantiene la longitud de los telómeros de los cromosomas.

Todo ello hace que las telomerasas guarden una relación de importancia con los procesos de envejecimiento y cáncer. A medida que nos vamos desarrollando, la acción de las telomerasas disminuye, se silencia, y a nivel bioquímico significa que los telómeros se van acortando progresivamente, produciendo el envejecimiento. La solución a esto sería que las telomerasas pudieran volver a expresarse, pero eso caracteriza a las células cancerosas, que se multiplican más rápidamente y de forma descontrolada e indefinida. Por tanto, un agente antitumoral podría ir contra la actividad de las telomerasas, pero así también se verían afectadas el resto de células de nuestro organismo.

6. PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA):

Esta reacción es una técnica que se desarrolla a partir de la replicación y que nos permite obtener copias de DNA a partir de una sola molécula de DNA, es decir, amplificar exponencialmente el DNA “in vitro”.

* NOTA: NO confundir con la proteína PCR (marcador de inflamación en los vasos)

Esta técnica, se basa en conocer el mecanismo de la replicación y aplicarlo in vitro para triplicar el DNA. Para ello se coloca el DNA en un tubo de ensayo sometiéndole a cambios de temperatura en tiempos muy cortos:

1. Se sube mucho la T para que se desnaturalicen las dos hebras del DNA
2. Se baja la T para que el DNA desnaturalizado hibride con los cebadores que hemos puesto.
3. Se sube la T para que se produzca la polimerización, es decir, se realiza la copia de DNA.

Este proceso se realiza en un termociclador. El secreto es que se pone una DNA polimerasa de un organismo termófilo que aguanta las altas temperaturas (Taq polimerasa)

Aplicaciones: ilimitadas, dependiendo de lo que se quiera hacer (diagnóstico)

Hay muchas modalidades: RT (retrotranscripción: expresión génica), PCR en tiempo real (conservar las proporciones)

7. 3 TÉCNICAS CLAVE DE AVANCE DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

• PCR: obtener todo el DNA que queramos a partir de una única muestra
• Método enzimático de secuenciación: secuenciar el genoma humano, basado en la replicación
• Descubrimiento de las endonucleasas de restricción: cortan el DNA por secuencias concretas, lo que nos permite cortar el DNA sabiendo por donde lo cortamos.